后醍醐天皇重新即位后，改元“建武”，实施新政。任命高级贵族任中央各机构的大臣以及地方的国司，并强化天皇本人的权限。一方面否定对天皇行使权利构成威胁的幕府、院政、摄政、关白等机构或职务，另一方面，废除知行国制度，土地所有权的证书均由后醍醐天皇亲手写成。中央机构设有处理重要政务的记录所、处理诉讼的杂诉决断所、统率军队的武者所、掌管奖赏的恩赏方等机构；地方机构每国均设守护、国司，同时设镰仓将军、陆奥将军，由后醍醐天皇的两个儿子担任其职。
后醍醐天皇实施的新政不到三年就结束了，其原因首先是权力过于集中，赏赐不均。重要政务完全由天皇本人决定，亲自签发土地所有权证书，难以做到客观公正。甚至其子护良亲王任征夷大将军也受到天皇的排挤，最后只好流落地方并被杀；其次是难以协调讨幕各派之间的矛盾。公家希望恢复贵族政治，武士希望恢复武家政治，传统势力要求复古，新兴势力要求革新，没有强大武力做后盾的后醍醐天皇难以平衡各派的利益冲突；另外，在百废待兴之际，朝廷还大兴土木，修建宫殿，并为此发行大量货币，增加税收，结果引起各界的不满；最重要的是，在进入武家时代以后，难以恢复律令时代的天皇政治结构。虽然镰仓幕府倒台，但武士的力量反而有所增强，他们对天皇朝廷未满足其要求而心怀怨言。尤其是作为武士领袖的足利高氏，因倒幕有功而被赐后醍醐天皇名字中的“尊”而称足利尊氏，但仍受到冷遇。
年，北条家族的旁支北条时行在关东地区起兵并占领镰仓，足利尊氏要求率军东征，并要求得到征夷大将军的称号，但遭到后醍醐天皇的拒绝。足利擅自率军出京都，并打败北条时行，夺回镰仓，同时明确表示反对朝廷。后醍醐天皇派遣新田义贞攻打足利，但被打败。1336年，足利被北畠显家打败，流落九州地区，但在各地武士的支持下，打败楠木正成，重新占领京都。足利废后醍醐天皇，拥立持明院系的光明天皇，并颁布了显示其执政方针的《建武式目》，内容包括禁奢侈，行俭约；镇暴行，止贿赂；戒官员缓怠，选贤者为吏；京中空地归还原主；受理贫弱之辈的诉讼；兴办专营金融借贷的土仓；委任忠诚足利氏的有军功者、有才干者为守护等，并在此基础上正式建立幕府。1338年，足利尊氏在又从光明天皇那里得到“征夷大将军”的称号。
年，被废黜的后醍醐天皇在同年底逃出京都，在京都南部吉野山组成另外一个朝廷，形成南北朝局面。最初两年尚有所对抗，但1339年后醍醐天皇去世，支持南朝的北畠显家、新田义贞等也相继战死，南朝已经没有实力与北朝对抗。但偏居一隅又缺乏武力的南部朝廷之所以能够经历四代天皇并坚持了57年时间，是因为室町幕府内部足利兄弟争权夺利的结果。
幕府成立之初，将军足利尊氏作为最高的统治者执掌恩赐、军事大权，其弟足利直义行使政务实权，但两人因统治理念的差异而发生冲突。即前者藐视传统权威并急于建立全国性政权，而后者主张尊重传统权威并渐进统一。两者的冲突后来发展成全国性的动乱，并轮流与南朝合作。首先是在1350年足利直义转向南朝，打败北朝军队后兄弟和好，但足利尊氏在取得南朝天皇的支持后，消灭了足利直义。其后，尊氏重新扶植北朝，而且幕府统治也逐渐稳定。直到第三代将军足利义满1368年执政后，采取各种措施成功地削弱了称霸一方的守护权力，进一步巩固了幕府的统治基础。1392年，足利义满呼吁南北朝统一，并得到南朝的积极反应，南朝后龟山天皇回到京都，并将象征天皇权威的三件神器交给北朝的后小松天皇，长达半个多世纪的南北朝对立基本结束。