人们首先怀疑的就是这个红色的药丸，因为皇上才吃过它就突然死去了，确实让人怀疑。《明史》中只说这是道士提供的“仙方”，但语之未详。有学者提出，红丸跟汉代的春恤胶属同类的药，主要功能是刺激男性的性欲，想想皇帝本来就因为纵欲而致病，再服这种药加以刺激，更是火上浇油，结果过量了，就导致了死亡。
不管这种红丸是什么药，吃死了皇帝，这可是不得了的事情，因此红丸一案的主要后继情节就追查害死皇上的凶手，不想却演变成了朝廷大臣之间争夺权力的斗争，党争与私仇夹杂其中，牵连受死的人很多。
首先受到怀疑的就是崔文昇和进红丸的李可灼。杨涟认为在此之前宫廷内外传言说皇上纵欲，实际上是崔文昇用来掩盖他用药害死光宗的借口，皇帝就是被崔文昇下药毒死的。杨涟的说法得到了当时的御史左光斗等人的支持。当时不少正直的大臣都认同这一说法，认为崔文昇的罪比李可灼还要大，因为他懂得医药，是有意用药加害光宗，进而又指出幕后主使人是郑贵妃，要求严惩崔文昇等人。
但是，对崔文昇的指控很不顺利，一直到明熹宗天启二年，中间几经反复。原因是，除了杨涟、左光斗等人外，朝中大臣大多从一开始就把矛头指向了当时担任内阁首辅的大学士方从哲，认为是他同意李可灼给皇帝用药的，因此最有罪的应该是方从哲。这实际上掺杂了很浓重的权力倾轧，这样，大臣们攻击的重点就不在李、崔二人，反而是方从哲。
之所以会这样，和方从哲本人的处置不当也有关。最初，对李可灼进红丸导致皇帝死亡应该被治死罪，大多数大臣都同意，但是方从哲却不同意，反而下令让李可灼以疾病引退，并送给他很多钱财。这样，其他敌对的官员就抓住了把柄，纷纷引经据典，认为方从哲同意李可灼进药，虽无害君之心，却有弑君之实，要求首先处置方从哲，以泄神人之愤。一开始，熹宗还为他开脱，这应该说不无道理。有学者从与方从哲一同主政的另一大臣韩爌（kuang）的叙述中发现，服不服红丸，都是光宗一人决定的，确实与方从哲无关。但是，在晚明时期，朝廷之中朋党互相倾轧非常厉害。既然有这样一个很好的攻击机会，方从哲的政敌自然不会放过，于是形成了一个攻击方从哲的群体。明末著名的东林党人也支持这一立场，名士高攀龙就力主惩罚方从哲，并称其为“贼臣”。结果，方从哲想逃脱罪责，慌忙上书请求退休，可说是被从首辅的位子上拉下来的。即便这样，声讨他、要求严办他的书文仍然很多，方从哲只好一面竭力为自己辩护，一面自请削职为民，远离中原。