如同前述，德川幕府本来规定天皇朝廷不得过问政治，但“黑船”叩关，幕府惊慌失措，破例向天皇报告事态，并向各地大名征求意见，结果却为天皇、公卿贵族以及强藩大名参政开辟了道路。在强藩的策动下，天皇拒绝批准签定《日美修好通商条约》，但幕府大老井伊直弼采取强硬态度，在没有天皇批准的情况下擅自签定了上述条约，并对反对派进行残酷镇压。有关大名被禁闭，长州藩士吉田松阴等人被处死，其他遭受迫害者多达近百人，史称“安政大狱”。
年，制造上述“安政大狱”的井伊直弼很快就被反对派袭击而死，标志着幕府专制统治的终结。受其冲击的天皇朝廷和幕府被迫转向相互联合的“公武合体”，具体措施就是撮合孝明天皇之妹与幕府将军家茂的婚姻。此后在天皇朝廷的要求下，幕府在1963年5月通告各藩采取“攘夷”行动。但在“公武合体派”的操纵下，发动政变，以下级武士为中心的“尊王攘夷派”受到迫害。得到天皇支持的幕府不仅将尊王攘夷志士赶出京都，并借口作为尊王攘夷派大本营的长州藩军队擅入京都而讨伐长州藩，迫使长州藩俯首称臣。
此时，尊王攘夷派的观念发生转化，即从尊王攘夷转向尊王倒幕。因为开港以后，面对咄咄逼人的西方侵略势力，下级武士主张以武力加以反对，因而时常有外国的士兵、使馆人员、商人甚至舰船在日本受到攻击的事件发生，其中的“生麦事件”和“下关事件”均引起与外国的局部战争。1862年9月，萨摩藩武士在神奈川县生麦村因道路纠纷而杀死英国商人，第二年7月英国七艘军舰炮击萨摩藩的鹿儿岛，摧毁了炮台，并焚烧了市区，萨摩藩被迫接受“赔偿”、“惩凶”等屈辱条件；1863年6月，长州藩炮击通过下关海峡的外国商船和军舰，并封锁下关海峡。1864年9月，英、美、法、荷四国联合舰队进攻下关，并攻陷了所有炮台，长州藩被迫求和。“萨英战争”和“下关战争”使主张尊王攘夷的下级武士意识到，在与外国武力相差悬殊的状况下进行攘夷是轻率的，抵御西方势力入侵，保障国家安全，只能打倒传统的幕府，建立一个强有力的、统一的近代民族国家。
正是在上述共同认识的基础上，西南两大强藩逐渐接近。在土佐藩出身的藩士坂本龙马的斡旋下，长州藩代表木户孝允和萨摩藩代表西乡隆盛在1866年3月签定密约，商定两藩结成讨幕军事同盟。正因如此，当同年7月幕府以“私购武器”、“私自对外贸易”等罪名准备发动第二次讨伐长州的战争时，曾是第一次讨伐长州战争主力的萨摩藩拒绝出兵，结果幕府不得不以将军去世而草草结束了这次不得人心的战争。1867年1月，主张公武合体的孝明天皇死亡，年仅15岁的太子睦仁即位，皇室公卿三条实美、岩仓具视等立即与西南诸藩策划武装讨幕，其他诸藩也加快了结盟举兵的步伐。1868年底，新天皇颁布“王政复古大号令”，宣布废除幕府，并命令幕府末代将军德川庆喜“辞官纳地”，即辞去内大臣等所有职务，交出半数领地给朝廷，此后一切权力重新归于天皇。与此同时，倒幕派组成了新的政府。